Tras una larga travesía desde Cuzco, atravesando el desierto de Atacama y los valles transversales y superando las hostilidades de algunos grupos indígenas, el conquistador extremeño Pedro de Valdivia llegó al valle del Mapocho, el lunes 13 de diciembre de 1540. Las huestes de Valdivia acamparon junto a las aguas del río, en los faldeos del cerro Tupahue y comenzaron lentamente a entablar relaciones con los indígenas picunches que habitaban la zona.

Pasados los peligros Valdivia convocó a los caciques de la zona a un solemne parlamento. A él asistieron líderes de diferentes territorios, desde Lampa hasta la región del Cachapoal. El conquistador español les explicó su intención: fundar una ciudad en nombre del rey Carlos I de España de la que sería su gobernación de Nueva Extremadura.​ Los indígenas habrían aceptado inicialmente, pensando en una segura expulsión de los forasteros en el futuro, y fue cedida una pequeña isla ubicada entre dos brazos del río junto a un cerro denominado como Huelén, el cual era de propiedad del cacique Huelén Huala.​ Tras la cesión de tierras, varios lof o clanes indígenas de las zonas cercanas al cerro Manquehue (denominadas como La Dehesa del Rey por los conquistadores) fueron trasladadas hacia otras zonas como Tango, Peñalolén y finalmente el pueblo de indios de Apoquindo.

El miércoles 12 de febrero de 1541, Valdivia fundaría oficialmente la ciudad de Santiago de Nueva Extremadura (Santiago del Nuevo Extremo) en honor al Apóstol Santiago, santo patrono de España, en las cercanías del Huelén, renombrado por el conquistador como «Santa Lucía». Siguiendo las normas coloniales, Valdivia encomendó el trazado de la nueva ciudad al alarife Pedro de Gamboa el cual diseñaría la ciudad en forma de damero. Éste tomaría como base del trazado el antiguo centro administrativo incaico, cuyo centro ceremonial pasaría a ser la Plaza Mayor, alrededor de la cual se destinaron solares para la Catedral, la cárcel y la casa del gobernador. En total se construyeron ocho cuadras de norte a sur y diez de oriente a poniente, y cada solar (un cuarto de cuadra) fue entregado a los colonizadores, que construyeron casas de barro y paja.

Junto a sus soldados, Valdivia partió meses después de la fundación de Santiago hacia el sur, dando inicio a las primeras campañas de la Guerra de Arauco. La ciudad quedó entonces desprotegida, momento perfecto para que las huestes indígenas de Michimalonco atacaran la incipiente urbe. El domingo 11 de septiembre de 1541, la ciudad fue arrasada por los indígenas; pero los 55 españoles, más un número indeterminado de yanaconas lograron resistir a los miles de atacantes, destacando la participación de Inés de Suárez, pareja de Valdivia y primera mujer europea en el país , quien asumió el comando del fuerte. Suárez ordenó la decapitación de siete caciques picunches y colgó sus cabezas para poder desmoralizar a las huestes aborígenes. Tras la destrucción de Santiago, la guerra se trasladó plenamente al sector del río Biobío lo que permitiría la reconstrucción de la ciudad, la que se vería afectada por un terremoto en 1552.

Con Santiago apenas resurgiendo tras la destrucción y la creciente preponderancia que adquiría el conflicto bélico, la recién fundada Concepción comenzó a adquirir mayor protagonismo. El conflicto de poder entre ambas ciudades se agudizaría en 1565 con la fundación de una Real Audiencia en esta última ciudad. Sin embargo, esta sería cerrada en 1575 y al ser restablecido este órgano en el Reino de Chile, en 1607, sería instalada en Santiago, debido al constante peligro que afrontaba Concepción, especialmente tras el desastre de Curalaba, y los terremotos de 1570 y 1575 que asolaron dicha localidad. Con la instalación de la Real Audiencia, Santiago quedó definitivamente establecida como la principal ciudad y capital del país.